酵母表達系統(tǒng)是真核表達系統(tǒng)中應用最廣泛的之一，其中巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii，又名Pichia pastoris）作為甲基營養(yǎng)型酵母的代表，近年來發(fā)展迅速，應用廣泛。

畢赤酵母：基因表達的新紀元

畢赤酵母表達系統(tǒng)誕生于上世紀80 年代初期，它融合了原核表達系統(tǒng)與真核表達系統(tǒng)的諸多優(yōu)點，迅速在眾多表達系統(tǒng)中脫穎而出。與原核表達系統(tǒng)相比，它不僅保留了操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達量高、成本低等特性，還具備原核生物所欠缺的對外源蛋白的翻譯后修飾能力，如糖基化、蛋白磷酸化等，使表達的重組蛋白更接近天然產(chǎn)物。同時，它又克服了釀酒酵母分泌效率差、表達菌株不穩(wěn)定、表達質(zhì)粒易丟失等缺陷，成為外源蛋白表達的理想選擇。

畢赤酵母表達系統(tǒng)的主要優(yōu)勢

1. 高效AOX1啟動子：目前最強、調(diào)控機制最嚴謹?shù)膯幼又?，便于調(diào)控外源基因的表達。

2. 蛋白加工修飾功能：可對表達的外源蛋白進行糖基化、磷酸化、脂類?；确g后修飾，使重組蛋白與天然產(chǎn)物更相似。

3. 低成本與高效生長：菌株生長迅速，培養(yǎng)基成本低廉，培養(yǎng)條件簡單。

4. 高表達量：外源蛋白表達量高，支持胞內(nèi)和分泌表達。

5. 基因穩(wěn)定整合：外源基因能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝形式穩(wěn)定整合，可穩(wěn)定遺傳50代以上。

6. 高密度發(fā)酵：耐受高密度發(fā)酵，便于工業(yè)化生產(chǎn)。

P. pastoris生產(chǎn)重組蛋白的流程

畢赤酵母菌株多樣性

當前所采用的巴斯德畢赤酵母菌株都源自原始的Y-11430菌，常用的有GS115、KM71、X33和SMD1168等。蛋白胞內(nèi)表達優(yōu)先選MutS表型，分泌表達Mut + 和MutS均可；多數(shù)菌株如SMD1168、GS115、KM-71是組氨酸脫氫酶缺陷型，可用不含組氨酸培養(yǎng)基篩選重組子，且SMD1168為蛋白酶缺陷型，適合表達不穩(wěn)定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復合物以避免內(nèi)源性蛋白酶降解。但SMD1168菌株生長緩慢，導致蛋白質(zhì)產(chǎn)量低

畢赤酵母常用表達載體

畢赤酵母表達載體分為分泌型和非分泌型兩大類，分別適用于不同類型的蛋白質(zhì)生產(chǎn)需求，其中分泌型載體利用釀酒酵母的分泌信號序列，有效引導外源蛋白的分泌，提高了蛋白的產(chǎn)量和純度。因此，深入了解和優(yōu)化畢赤酵母表達載體，對于提升蛋白生產(chǎn)效率和質(zhì)量至關重要，也是當前生物技術和基因工程研究中的熱點之一。

常見的用于生產(chǎn)分泌蛋白的畢赤酵母表達載體【1】

常見的用于生產(chǎn)胞內(nèi)蛋白的畢赤酵母表達載體【1】

畢赤酵母基因改造技術

1. 基于線性化質(zhì)粒載體的同源重組

同源重組技術是一種利用生物體自身修復機制的基因工程技術。在畢赤酵母中，通過將線性化的質(zhì)粒載體引入，可以高效地將外源基因整合到宿主基因組的特定位點。這一過程依賴于同源臂序列，這些序列與目標基因組區(qū)域具有高度相似性，從而促進了質(zhì)粒載體與宿主DNA之間的重組。這種方法的優(yōu)勢在于其操作簡便、整合效率高，可以實現(xiàn)外源基因的多拷貝插入，這對于提高基因表達水平和蛋白質(zhì)產(chǎn)量至關重要。在工業(yè)生產(chǎn)中，這種技術常被用于優(yōu)化基因表達，以滿足生物制藥和工業(yè)酶生產(chǎn)的需求。此外，同源重組技術還可以用于基因功能研究、疾病模型構建以及生物技術產(chǎn)品的開發(fā)。

2. 基于CRISPR/Cas9的基因編輯

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種革命性的基因編輯技術，它通過利用指導RNA（gRNA）引導核酸酶Cas9精確切割目標DNA序列。這種特異性的切割觸發(fā)了細胞內(nèi)的修復機制，包括非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復（HDR），從而實現(xiàn)基因的敲除、插入或替換。CRISPR/Cas9技術以其高效性和精準性在基因組編輯領域占據(jù)重要地位，特別適用于復雜代謝途徑的優(yōu)化和多基因編輯。在畢赤酵母中，CRISPR/Cas9技術已被廣泛應用于基因功能研究、菌株改良以及生產(chǎn)性能的提升。例如，通過敲除或替換特定基因，可以增強宿主菌的蛋白質(zhì)表達能力或改變其代謝特性，以適應特定的工業(yè)生產(chǎn)需求。

3. 基于CRISPR/Cas12的基因編輯

CRISPR/Cas12系統(tǒng)，也稱為Cpf1，是CRISPR家族中的另一種基因編輯工具。Cas12蛋白具有廣泛的靶向能力和單鏈DNA切割特性，使其在基因組編輯中具有獨特的優(yōu)勢。與Cas9相比，Cas12對靶位點的PAM（原始間隔短回文重復序列）依賴性更寬松，這為基因編輯提供了更大的靈活性。CRISPR/Cas12系統(tǒng)在表觀遺傳調(diào)控和新型生物技術的開發(fā)中展現(xiàn)出巨大潛力，例如，它可以用于研究基因沉默、激活以及DNA甲基化等表觀遺傳修飾。此外，Cas12的單鏈切割特性使其在開發(fā)新型核酸檢測技術、基因治療策略以及合成生物學應用中具有獨特的應用前景。在畢赤酵母中，CRISPR/Cas12技術的應用還相對較新，但已有研究表明，它在基因組編輯和基因功能研究中具有巨大的潛力。

畢赤酵母創(chuàng)新突破

經(jīng)過幾十年的廣泛應用，畢赤酵母表達系統(tǒng)已成功表達了數(shù)以千計的異源蛋白，其中大部分為醫(yī)藥制品。美國FDA 對該系統(tǒng)的認可，如 Cephelon 制劑的獲批，充分證明了其安全性和有效性。在我國，雖然目前上市的基因工程藥物大多源于大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，但畢赤酵母表達系統(tǒng)憑借其國際上的廣泛認可，必將在未來的醫(yī)藥市場中占據(jù)重要地位。

泓迅生物

酵母基因編輯 & 重組蛋白表達平臺

泓迅生物利用CRISPR等新技術，實現(xiàn)了對畢赤酵母基因組的精準編輯，包括基因敲除、插入和替換。我們成功敲除了GS115菌株的KU70基因，顯著提高了畢赤酵母的重組效率和外源基因的整合頻率，同時敲除了pep4基因，降低了外源蛋白被降解的風險。

我們深耕合成生物學領域，擁有豐富的基因合成、重組蛋白表達和基因編輯經(jīng)驗。我們提供一站式解決方案，幫助解決畢赤酵母蛋白表達和基因改造的需求，最大限度縮短研發(fā)周期。

》案例展示

通過對畢赤酵母GS115的基因改造，提高了菌株對外源蛋白的表達和分泌。并利用該重組菌株成功表達了多個人源重組蛋白的高效分泌表達，培養(yǎng)液中雜蛋白很少，產(chǎn)量預計可達10g/L。

》免費樣品測試

· 可免費提供少量蛋白樣品以供測試。

· 菌株、蛋白等相關信息可聯(lián)系本司咨詢。

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未來展望

畢赤酵母表達系統(tǒng)以其高表達、高密度、多樣化翻譯后修飾以及無內(nèi)毒素和病毒的安全性等優(yōu)勢，成為重組蛋白表達的優(yōu)選平臺。CRISPR/Cas9等基因組編輯技術的應用將進一步推動該系統(tǒng)的發(fā)展，助力重組人源蛋白在生物醫(yī)藥、美容護膚等領域的研究和應用。

重組膠原蛋白基因的選擇和設計、表達條件的優(yōu)化和驗證對于獲得高產(chǎn)量的蛋白至關重要。泓迅生物提供從“序列優(yōu)化”到“基因合成”到“重組膠原蛋白表達”一站式服務。高效的基因合成、多種表達體系協(xié)助您在實驗室低成本無限合成，提高膠原蛋白的表達量、親水性和可加工性，創(chuàng)造更多應用可能。

參考文獻

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